在辅助生殖技术(assisted reproduction techno-logy,ART)实施过程中,精子收集和处理非常重要。其目的是收集到一定数量具有受精潜能的活动精子用于体外受精。对于大部分男性不育患者，可通过手淫法从射出的精液中收集精子。但对无精子症或有射精功能障碍(如不射精症和逆行射精等)等的男性不育患者，可能需要通过从睾丸/附睾或者其他特殊方法获取精子。对少部分严重精子异常和不可逆的无精子症患者,最后可能需要使用供精来助孕。

一、常规精子收集方法

大部分男性可在禁欲2~7天后，在女方取卵日采用手淫法收集射出精液于一干净无毒无菌容器。待精液液化后，根据精子浓度、活力选择直接上游法、密度梯度离心法或一步离心法进行的活动精子收集。

(一)直接上游法

上游法常用于精液参数基本正常的样本处理是利用精子自身的运动能力将活动精子从精浆中分离出来。该方法简单、经济、实用。对精子数量和活动力正常的标本，很容易获得足够数量的活动力好的精子。

(二)密度梯度离心法

该方法能很好地将精子和其他细胞成分及碎片分开.是分离高质量精子的最佳方法.比上游法更易于标准化，结果也更稳定。目前较常用的是非连续密度梯度离心法，常用于IVF和卵细胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperminjectionICSI)中的精子制备。对于严重少弱畸形精子症，采用此方法可回收到更多的活动精子。目前最常用的是由40%密度梯度液(上层)和80%密度梯度液(下层)组成的双层密度梯度液离心法。

(三)一步离心法

该方法程序简单,更常用于严重少弱畸形精子症或附睾睾丸精子行ICSI时，可回收最多的精子

1.将培养液按一定比例加入精液标本(1:2).吹打混匀后200g离心5分钟，弃上清。

2.加入一定体积的培养液重悬精子沉淀，200g离心5分钟，弃上清再加Iml培养液重悬沉淀。

二、其他精子收集方法

(一)冷冻精液的精子收集

冻存精液使用前要先进行复苏，即将液氮中的精液冻存管取出,稍微拧松管盖,放出管中负压气体后,投入37℃水浴 10分钟。精液融解后根据精子浓度、活力及受精患者的ART治疗方案等，采取一步离心法或密度梯度离心法等对精液进行精子收集。应按照精液原质量或解冻后质量选择以下处理方法。

1.宫颈管内人工授精 冷冻精液经复苏后直接用于宫颈管内人工授精(intracervical insemination.ICI)

2.宫腔内人工授精用于宫腔内人工授精(intrauterine insemination,1U1)的精液经复苏后通常采用一步离心法进行收集。KaramahmutogluH等研究认为使用密度梯度离心法结合上游法收集精子可以提高IU的妊娠成功率。XueX等认为密度梯度离心法结合上游法有助于畸形精子症患者收集形态正常、DNA完整的精子。密度梯度离心法结合上游法,即在非连续密度梯度离心后再增加一个上游法收集精子，两种方法的优点相结合，使精子的回收率及质量大大提高。

3.输卵管内精液灌注用于输卵管内精液灌注(fallopian tube sperm perfusionFSP)的精液经复苏后先用一步离心法处理,再用相应的培养液稀释至3~4ml放置于5%CO培养箱内培养30-60分钟。PeivandiS等报道，与IUI相比.在提高不明原因不育患者妊娠率方面，FSP所使用的输卵管精子转移(fallopian sperm transferFAST)系统并未显示出优势。

4.体外受精胚胎移植术通常采用密度梯度离心法收集精子。对于不可逆的无精子症、极严重的少弱畸形精子症及伴有不宜生育的严重遗传性疾病者的治疗，可能需行供精人工授精(artificialinsemination with donorspermAID)或供精体外受精(in vitro fertilization with donor sperm,D-IVF)

(二)不射精症的精子收集

除常见的不射精症之外，临床上有极少部分平时射精正常的患者.在女方取卵日当天可能由于精神紧张和焦虑,出现暂时的境遇性射精障碍，发生率占不射精患者的0.4%~0.5%。两者均可通过阴茎振动刺激(penile vibratorystimulation,PVS)和电刺激采精(electroejaculationEEJ)采集精液，再用密度梯度离心法收集精子。

(三)逆行射精症的精子收集

逆行射精(retrograde ejaculation,RE)可从尿液中收集精子。采精前服用碳酸氢钠可碱化尿液，改善维持进人尿液的精子活力。患者取精前先排一部分尿液，但不完全排空膀胱;通过手淫法达到射精，如有精液排出，收集于一干净无毒无菌容器，立即排尿至另一个盛有培养液的容器,使其进一步碱化。排出的精液和尿液均检查有无精子。将尿液以500xg离心8分钟进行浓缩。浓缩后的尿液沉淀和精液(如果有的话)，通过密度梯度离心法进行精子收集。

(四)无精子症的精子收集

无精子症患者需要通过手术从睾丸组织或附睾中获取精子。

1.附睾精子 由于附墨穿刺的适应证是梗阻性无精子症，相对面言能获得较多的精子，且附睾穿刺所获得样本中红细胞和非精子细胞的污染通常极少,活动精子的分离和优选相对简单。一般采用密度梯度离心法收集精子如果精子的数目较少，则采用一步离心法进行收集。

2.睾丸精子睾丸精子可通过开放式睾丸活检(testicular spermextractionTESE)经皮睾丸穿刺(testicular spermaspirationTESA)或翠丸切开显微取精(microdissection testicular sperm extraction,Micro-TESE)来获取。这三种活检方法比较起来，Micro-TESE可以在手术显微下将睾丸曲细精管放大几十倍,获取可能具有生精功能的相对饱满的曲细精管，对于非梗阻性无精子症患者来说，获得睾丸精子的可能性更大。睾丸标本常带有非生殖细胞和大量红细胞，因此需要通过额外的酶学或机械方法来分离精子。由于从睾丸获得的精子数量少，活力差,只能用于ICSI。

(1)酶法:向睾丸组织中加入胶原蛋白酶.37℃孵育1.5~2小时，每30分钟涡旋振荡一次。再以100xg离心10分钟，收集精子沉淀团。

(2)机械法:在体视显微镜下使用1ml注射器针尖小心地剥开曲细精管或者用90°弯曲的1ml注射器针把精子从曲细精管里挤压出来。如果还是不能查见任何精子，可以用眼科剪把曲细精管剪碎，在倒置显微镜下仔细观察和寻找精子。有的非梗阻性无精子症患者通过睾丸获取的标本可能只有几个精子，因此，对于此类标本,实验室技术人员需要心细和耐心。